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GATA4 expression

GATA4 mRNA は心臓、腸、生殖巣、肝臓、内臓内胚葉 visceral endoderm および体壁内胚葉 parietal endoderm で見られる。GATA4 は、マウス心筋細胞の発生で最も早く発現する転写因子の一つである。GATA4 mRNA は、7.0-7.5 dpc において前心臓中胚葉 precardiac mesoderm で検出される。さらに、心筒 heart tube が形成される 8.0 dpc には、心内膜 endocardium、心筋 myocardium、前心臓中胚葉でも見られる。GATA4 mRNA は心筋細胞 cardiomyocytes で一生豊富に発現し続ける。マウス成体では、GATA4 転写産物は生殖巣、肺、肝臓、小腸でも見られる。

GATA4 は、肝臓前駆細胞のアルブミン遺伝子プロモーターに最も早い時期に結合する因子である。GATA4 は silent chromatin サイト (compacted chromatin) に結合し、ATP 依存的酵素の非存在下で local nucleosomal domain を開くことができる。心筋細胞において、GATA4 が chromatin remodeling 転写因子として働くかどうかはわかっていない。

GATA4 は心筋肥大刺激にともなって活性化される。GATA4 は過負荷の圧力をかけた (pressure-overloaded) 心臓の核分画から検出されるが、通常の心臓の核分画からは検出されない。

GATA4 in cardiogenesis

P19 癌性胚細胞 embryonal carcinoma cell では、GATA4 の過剰発現は拍動心筋細胞 beating cardiocyte への分化を増進する。逆に、GATA4 の抑制は心筋細胞への分化を妨げ、広範なアポトーシスを誘導する。マウス顆粒膜細胞でも、GATA4 の downregulation はアポトーシスを増進する。逆に、GATA4, GATA6 の過剰発現は、anthracycline（抗腫瘍性抗生物質）によって誘導されるアポトーシスから心筋を守る。GATA4 を欠損した ES 細胞は、 in vitro では心筋細胞へ分化し得るが（割合は減少する）、適切な内臓内胚葉や最終的な内胚葉を作り出す能力を部分的に欠く。

GATA4 が不活性化したトランスジェニックマウスは、胚発生において腹側の形態と心筒の形成不全のため、8.0-9.0 dpc に死ぬ。GATA4 ノックアウトマウスでも心筋分化は妨げられず、ANF (atrial natriuretic peptide; 心房性ナトリウム利尿ペプチド）、α-MHC (α-myosin heaby chain) は正常に発現する。GATA4 null 変異体マウスの胚では、GATA6 mRNA が増加する。これは、GATA6 が GATA4 の欠如を補っていることを示唆する。GATA4 は適切な内胚葉分化と腹側の形態形成に不可欠であるが、心筋細胞分化には必須ではない。

GATA4 は他の組織（生殖巣など）で、心臓よりも高いレベルで発現する。一方で、心発生および心肥大 cardiac hypertrophy において、GATA4 は心臓特異的な遺伝子の転写を活性化する。したがって、心臓特異的な転写制御を実現するには、何らかの付加的なメカニズムが存在すると考えられる。

Target genes of GATA4

GATA4 は、例えば以下の遺伝子の転写を活性化する。

• α-MHC
• cardiac troponin C and troponin I
• myosin light chain-1, -3
• ANF
• BNP (B-type natriuretic peptide)
• corin (cardiac enzyme involved in the processing of natriuretic peptides)
• Na⁺/Ca²⁺-exchanger
• acetylcholine receptor-M₂
• CARP (cardiac-restricted ankyrine repeat protein)
• adenosine receptor-A₁
• carnitine palmitoyltransferase-1β
• cardiac-restricted ankyrine repeat protein
• m2 muscarinic receptor

特に心臓においては、例えば、過負荷の圧力をかけたラットでは β-MHC および AT₁ (angiotensin II type 1 receptor) の発現誘導が見られるが、そのためには、これらの遺伝子のプロモーターにある GATA エレメントが必要である。また、GATA エレメントは adenylosuccinate synthetase-1、BNP、preproendothelin の転写にも必要である。Endothelin-1 (ET-1) は GATA サイト依存的に ANF および BNP の転写を活性化する。また、GATA4 および GATA6 は BMP-4 (bone morphogenic protein-4) や preproendothelin の転写を増進するが、BMPs と ET-1 は GATA4 の activator でもある。

最も重要なのは Nkx2.5 である。マウス Nkx2.5 のプロモーター領域には二つの GATA エレメントがあり、GATA4 が結合する。胚発生初期における心臓、咽頭 pharynx、脾臓 spleen での Nkx2.5 の発現に GATA4 は必須である。

GATA4 in cardiac hypertrophy

GATA4 の DNA 結合活性は、肥大刺激の開始に伴って増加する。灌流して単離したラットの心臓では、ET-1 と Ang II (angiotensin II) を通じて GATA4 の DNA 結合が活性化される。肥大刺激をかけられたラットの心臓では、初期の GATA4 の DNA 結合活性は三十分後にピークに達する。これは ET-1 のピーク (30-60 min) や ISO のピーク (30 min) とよく対応する。ET-1 と PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate) で処理した HL-1 細胞（不死化した成体マウスの心房性筋細胞）では、GATA4 の DNA 結合活性のピークは十分後である。Ang II で処理した場合は、最大三十分後にピークが来る。

GATA4, GATA6 の過剰発現は、新生児ラット心筋の培養系および、トランスジェニック・マウスの心臓において肥大成長を促進する。ET-1 処理した新生児ラットの心筋に合成 GATA 配列を加えると、ANF、BNP の発現が低下する。Adenovirus による GATA4 RNAi を行うと、機械的刺激、PE (phenylephrine)、ET-1 に対する心肥大応答が抑制される。

Phosphorylation of GATA4

ERK, p38 MAPK

マウス GATA4 の Ser¹⁰⁵ は、GATA4 による転写制御に必要である。Ser¹⁰⁵ に変異を挿入すると、GATA4 の DNA 結合活性が減少する。Ser¹⁰⁵ のリン酸化は GATA4 を安定させると考えられている。心筋細胞で Ser¹⁰⁵ を特異的にリン酸化するのは、ERK (extracellular signal-regulated kinase) と p38 MAPK である。p38 MAPK は RhoA (small GTPase) によって活性化される。ERK は PE に反応して GATA4 をリン酸化する。RhoA の下流にある ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase) に対する阻害剤は、PE による ERK リン酸化の増進と、GATA4 の DNA 結合活性を抑制する。

新生児ラットの心筋を ET-1、PE、ISO などで処理すると、GATA4 のリン酸化と、それにともなう DNA 結合活性の増進が見られる。ET-1 は p38 MAPK と ERK の両方を活性化する。p38 MAPK は ET-1 による GATA4 の活性化を取り次ぎ、ERK は GATA4 の基本的な DNA 結合を制御している考えられる。HL-1 細胞においても、ET-1 と PMA が GATA4 のリン酸化を増進する。肺動脈平滑筋 pulmonary artery smooth muscle の培養細胞では、セロトニンが MEK/ERK を介して GATA4 の DNA 結合を活性化する。

ラットの虚血性心肥大モデルでは、HGF (hepatocyte growth factor) の発現が上昇する。HGF を投与すると心筋細胞のアポトーシスを抑制され、梗塞相 infarct area のサイズが減少し、心機能が向上する。HGF は MEK1/ERK 経路を介して GATA4 の Ser¹⁰⁵ をリン酸化し、GATA4 を活性化する。

GATA4 には、MAPK が標的とし得る Ser 残基が Ser¹⁰⁵ の他に少なくとも 6つある。 これらの残基のリン酸化は、GATA 依存的な転写調節に関与している可能性がある。

MAPK 経路は、GATA4 の他にも、MEF-2 (myocyte enhancer factor-2)、Elk-1 (ETS-like gene-1)、NFAT (nuclear factor of activated T-cells) などの心筋肥大制御に関わる因子も活性化する。ERK と p38 MAPK 経路はそれぞれ、代償的心筋肥大と拘束型心筋症を誘導する。

GSK-3β

GATA4 はまた、GSK-3β (glycogen synthase kinase-3β) の標的でもある。GSK-3β は、心筋肥大をネガティブに制御する。GSK-3β は、PKB/Akt によって抑制される。PKB/Akt は PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) の下流にある。したがって、PI3K の活性化は GSK-3β を抑制する。GSK-3β は物理的に GATA4 と相互作用し、GATA4 の N 末端ドメイン (2-205) をリン酸化する。このリン酸化は GATA4 の核内レベルを下げ、GATA4 依存的な転写制御を阻害する。

GSK-3β の不活性化は、GATA4 の cofactor である NFAT の核内移動と連動している。GSK-3β は、MAPK と並行して、GATA4 による遺伝子発現を制御していると考えられる。

PKA

生殖細胞では、ジブチル cAMP 処理は、PKA を介した GATA4 のリン酸化を増進する。リン酸化される Ser²⁶¹ は 2つの Zn finger の間に位置し、進化的に保存されている。PKA による GATA4 のリン酸化は、CBP (cAMP responsive element-binding protein) などの co-activator を補充する。NIH3T3 細胞において、CBP は GATA4 による転写を刺激し得るが、心筋において PKA 依存的な GATA4 制御機構が存在するかどうかはわかっていない。

Acetylation of GATA4

CBP と近い関係にある p300 は、ヒストンのアセチル化に働く。これは GATA4 と p300/CBP の相互作用による相乗的な転写活性化に必要である。しかし、p300/CBP が GATA4 を直接アセチル化するかどうかはわかっていない。NIH3T3 細胞では、過剰発現した p300 は GATA4 の Lys 残基をアセチル化しない。COS7 細胞を用いた同じ実験では、GATA4 がアセチル化される。心筋特異的に p300 を過剰発現するトランスジェニック・マウスは、アセチル化と DNA 結合活性が亢進した GATA4 によって、心肥大を発症する。

Cofactors of GATA4

GATA4 の C 末端側 Zn finger は DNA 結合に必要だが、cofactor や co-activator の結合部位でもある。また、FOG2 は N 末端側の Zn finger に結合し、GATA6 は両方の Zn finger と相互作用する。V217G 置換を持つ GATA4 は FOG2 と結合できず、そのトランスジェニック・マウスは FOG2 欠損変異体と似た表現型（冠状脈 coronary vasculature の欠如および隔壁形成 septation 不全）を示す。

協調的な転写活性化には、GATA4 の N and/or C 末端の活性化ドメインが必要である。転写活性を制御するために、p300/CBP 、dHAND、RXRα (retinoid X receptor-α)、Yin Yang-1 などとの結合が恐らく同時に起こる。

Nkx2.5, TBX-5

GATA4, SRF (serum response factor), Nkx2.5 は協調的な転写活性のために複合体を形成する。ヒトにおける Nkx2.5 の変異は、先天的な心臓疾患を引き起こす。これらの変異は、Nkx2.5 の DNA 結合活性を失わせる。また、変異 Nkx2.5 と GATA4 は、ANF プロモーターの異常な転写活性を示す。

ヒト GATA4 の G296S (マウスでは G295S) 変異は、心中隔欠損を起こす。この変異は GATA4 の DNA 結合活性を下げ、TBX-5 との結合を失わせる (Nkx2.5 とは結合できる)。また、ヒト GATA4 のフレームシフト変異は、N 末端 40残基ほどの欠損をもたらし、心房隔壁に欠陥を起こす。これらの結果は、GATA4、Nkx2.5、TBX-5 などの変異による複合体形成不全が、心臓形成異常をもたらすことを示している。

BNP プロモーターの GATA エレメントに変異を挿入すると、BNP mRNA は 40% ほどに抑制される。NKE に変異を挿入しても影響はない。しかし、GATA エレメントと NKE に同時に変異を挿入すると、完全に発現が抑制される。これらは、標的遺伝子上において GATA4 と Nkx2.5 が協同的に転写を制御していることを示唆する。

事実、P19 細胞における GATA4 と Nkx2.5 の相互作用は、GATA4 単独よりも強く ANF を活性化し、心筋発生を増進する。

NFAT

Ca²⁺/CaM は calcineurin などの phosphatase を活性化する。Calcineurin は NFATc4 (NFAT-3) を脱リン酸化する。構成的な calcineurin の活性化は、NFATc4 と GATA4 を通じて協同的にヒト BNP プロモーターを活性化する。Calcineurin の抑制は、ET-1、Ang II、PE によって誘導される心肥大を妨げる。また、ET-1 処理した新生児ラットの心筋では、GATA4 と NFATc の相互作用が強まる。

Hypertrophic stimuli (ET-1 etc.) → calcineurin → GATA4-NFAT interaction

MEF-2

細胞内 Ca²⁺ 濃度を上げると CaMKII は自己リン酸化し、Ca²⁺ 非依存な活性状態となる。心臓で CaMKIIδ が過剰発現するトランスジェニック・マウスは心肥大を起こす。CaMK は、HDAC (histone deacetylase) を解離することによって MEF-2 を活性化する。HDAC の抑制が解かれた MEF-2 は、MAPK によって転写活性ドメインをリン酸化され、最大限に活性化される。

MEF-2-HDAC
↓ ← CaMKII
MEF-2
↓ ← MAPK
MEF-2~(P)

GATA1, GATA2 は HDAC と相互作用することによって抑制されている。しかし心筋において、GATA4 が直接 HDAC と相互作用しているかどうかはわかっていない。

SRF

CaMK 依存的な HDAC の解離は、心筋における SRF の転写活性も増進する。加えて、SRF は MAPK 依存的な活性を経て、心筋遺伝子の発現を制御すると考えられている。SRF、GATA4 and/or GATA6 は、ANF プロモーターの 30 bp cis-element 上で複合体を形成し、ET-1 処理された新生児ラット心筋において、ANF プロモーターの活性を制御する。心筋特異的に SRF を過剰発現するトランスジェニック・マウスは心肥大を起こす。

GATA4 (C57BL6)

GATA4 cDNA sequence (C57BL6)

ATGTACCAAA GCCTGGCCAT GGCCGCCAAC CACGGCCCCC CGCCCGGCGC CTACGAAGCA GGTGGCCCTG GCGCCTTCAT GCACAGCGCG GGCGCCGCGT CCTCGCCCGT CTACGTGCCC ACTCCGCGGG TGCCGTCCTC TGTGCTGGGC CTGTCCTACC TGCAGGGCGG TGGCAGTGCC GCTGCAGCTG GAACCACCTC GGGTGGCAGC TCCGGGGCCG GCCCGTCGGG TGCAGGGCCT GGGACCCAGC AGGGTAGCCC TGGCTGGAGC CAAGCTGGAG CCGAGGGAGC CGCCTACACC CCGCCGCCCG TGTCCCCGCG CTTCTCTTTC CCGGGGACTA CTGGGTCCCT GGCGGCCGCT GCCGCCGCTG CCGCAGCCCG GGAAGCTGCA GCCTACGGCA GTGGCGGCGG GGCGGCGGGC GCTGGTCTGG CTGGCCGAGA GCAGTACGGG CGTCCGGGCT TCGCCGGCTC CTACTCCAGC CCCTACCCAG CCTACATGGC CGACGTGGGA GCATCCTGGG CCGCAGCCGC TGCCGCCTCT GCCGGCCCCT TCGACAGCCC AGTCCTGCAC AGCCTGCCTG GACGGGCCAA CCCTGGAAGA CACCCCAATC TCGATATGTT TGATGACTTC TCAGAAGGCA GAGAGTGTGT CAATTGTGGG GCCATGTCCA CCCCACTCTG GAGGCGAGAT GGGACGGGAC ACTACCTGTG CAATGCCTGT GGCCTCTATC ACAAGATGAA CGGCATCAAC CGGCCCCTCA TTAAGCCTCA GCGCCGCCTG TCCGCTTCCC GCCGGGTAGG CCTCTCCTGT GCCAACTGCC AGACTACCAC CACCACGCTG TGGCGTCGTA ATGCCGAGGG TGAGCCTGTA TGTAATGCCT GCGGCCTCTA CATGAAGCTC CATGGGGTTC CCAGGCCTCT TGCAATGCGG AAGGAGGGGA TTCAAACCAG AAAACGGAAG CCCAAGAACC TGAATAAATC TAAGACGCCA GCAGGTCCTG CTGGTGAGAC CCTCCCTCCC TCCAGTGGTG CCTCCAGCGG TAACTCCAGC AATGCCACTA GCAGCAGCAG CAGCAGTGAA GAGATGCGCC CCATCAAGAC AGAGCCCGGG CTGTCATCTC ACTATGGGCA CAGCAGCTCC ATGTCCCAGA CaTTCAGTaC TGTGTCCGGC CACGGGCCCT CCATCCATCC AGTGCTGTCT GCTCTgAAGC TGTCCCCACA AGGCTATGCA TCTCCTGTCA CTCAGACATC GCAGGCCAGC TCCAAGCAGG ACTCTTGGAA CAGCCTGGTC CTGGCTGACA GTCATGGGGA CATAATCACC GCGTAA

1326 bp。赤字; U85046 にはない (C57BL6 で挿入された) 塩基。

GATA4 amino acid sequence (C57BL6)

MYQSLAMAAN HGPPPGAYEA GGPGAFMHSA GAASSPVYVP TPRVPSSVLG LSYLQGGGSA AAAGTTSGGS SGAGPSGAGP GTQQGSPGWS QAGAEGAAYT PPPVSPRFSF PGTTGSLAAA AAAAAAREAA AYGSGGGAAG AGLAGREQYG RPGFAGSYSS PYPAYMADVG ASWAAAAAAS AGPFDSPVLH SLPGRANFGR HPNLDMFDDF SEGRECVNCG AMSTPLWRRD GTGHYLCNAC GLYHKMNGIN RPLIKPQRRL SASRRVGLSC ANCQTTTTTL WRRNAEGEPV CNACGLYMKL HGVPRPLAMR KEGIQTRKRK PKNLNKSKTP AGPAGETLPP SSGASSGNSS NATSSSSSSE EMRPIKTEPG LSSHYGHSSS MSQTFSTVSG HGPSIHPVLS ALKLSPQGYA SPVTQTSQAS SKQDSWNSLV LADSHGDIIT A*

441 a.a.、44.4 kDa (44429.9 Da)。下線; zn finger、灰色; NLS、青字; U85046 と異なる配列。

GATA4 (U85046)

GATA4 cDNA sequence (U85046)

ATGTACCAAA GCCTGGCCAT GGCCGCCAAC CACGGCCCCC CGCCCGGCGC CTACGAAGCA GGTGGCCCTG GCGCCTTCAT GCACAGCGCG GGCGCCGCGT CCTCGCCCGT CTACGTGCCC ACTCCGCGGG TGCCGTCCTC TGTGCTGGGC CTGTCCTACC TGCAGGGCGG TGGCAGTGCC GCTGCAGCTG GAACCACCTC GGGTGGCAGC TCCGGGGCCG GCCCGTCGGG TGCAGGGCCT GGGACCCAGC AGGGTAGCCC TGGCTGGAGC CAAGCTGGAG CCGAGGGAGC CGCCTACACC CCGCCGCCCG TGTCCCCGCG CTTCTCTTTC CCGGGGACTA CTGGGTCCCT GGCGGCCGCT GCCGCCGCTG CCGCAGCCCG GGAAGCTGCA GCCTACGGCA GTGGCGGCGG GGCGGCGGGC GCTGGTCTGG CTGGCCGAGA GCAGTACGGG CGTCCGGGCT TCGCCGGCTC CTACTCCAGC CCCTACCCAG CCTACATGGC CGACGTGGGA GCATCCTGGG CCGCAGCCGC TGCCGCCTCT GCCGGCCCCT TCGACAGCCC AGTCCTGCAC AGCCTGCCTG GACGGGCCAA CCCTGGAAGA CACCCCAATC TCGATATGTT TGATGACTTC TCAGAAGGCA GAGAGTGTGT CAATTGTGGG GCCATGTCCA CCCCACTCTG GAGGCGAGAT GGGACGGGAC ACTACCTGTG CAATGCCTGT GGCCTCTATC ACAAGATGAA CGGCATCAAC CGGCCCCTCA TTAAGCCTCA GCGCCGCCTG TCCGCTTCCC GCCGGGTAGG CCTCTCCTGT GCCAACTGCC AGACTACCAC CACCACGCTG TGGCGTCGTA ATGCCGAGGG TGAGCCTGTA TGTAATGCCT GCGGCCTCTA CATGAAGCTC CATGGGGTTC CCAGGCCTCT TGCAATGCGG AAGGAGGGGA TTCAAACCAG AAAACGGAAG CCCAAGAACC TGAATAAATC TAAGACGCCA GCAGGTCCTG CTGGTGAGAC CCTCCCTCCC TCCAGTGGTG CCTCCAGCGG TAACTCCAGC AATGCCACTA GCAGCAGCAG CAGCAGTGAA GAGATGCGCC CCATCAAGAC AGAGCCCGGG CTGTCATCTC ACTATGGGCA CAGCAGCTCC ATGTCCCAGA CTTCAGTCTG TGTCCGGCCA CGGGCCCTCC ATCCATCCAG TGCTGTCTGC TCTAAGCTGT CCCCACAAGG CTATGCATCT CCTGTCACTC AGACATCGCA GGCCAGCTCC AAGCAGGACT CTTGGAACAG CCTGGTCCTG GCTGACAGTC ATGGGGACAT AATCACCGCG TAA

References